Nga take pokanoa i nga tauhohenga PCR

I te wa o te tauhohenga PCR, he maha nga wa ka pa ki etahi mea whakararu.
Na te kaha o te tairongo o te PCR, ka kiia ko te poke tetahi o nga mea tino nui e pa ana ki nga hua PCR ka taea te whakaputa hua pai teka.
He rite tonu te whakahirahira ko nga momo puna e arahi ana ki nga hua kino-kore. Mena ka aukatia, ka pokanoa ranei tetahi waahanga nui atu ranei o te ranunga PCR, te tauhohenga whakakaha ake ranei, ka taea te arai i te whakamatautau tātaritanga. Ka taea e tenei te whakaheke i te kaha me nga hua kino kino.
I tua atu i te aukati, ka ngaro pea te tika o te waikawa nucleic na runga i nga tikanga tuku me te rokiroki i mua i te whakarite tauira. Otirā, ko te nui o te pāmahana, te takarepa ranei o te rokiroki ka pa ki te kino o nga pūtau me te waikawa karihi. Ko te whakatikanga o te pūtau me te kiko me te whakauru paraffini nga take e mohiotia ana mo te wehenga DNA me te raru tonu (tirohia nga Whakaahua 1 me te 2). I enei keehi, ahakoa ko te wehe me te purenga tino pai kaore e awhina.

Whakaahua 1 | Te awenga o te immobilization i runga i te tapatahi DNA
I whakaatuhia e te electrophoresis gel Agarose he rerekee te kounga o te DNA i wehea mai i nga waahanga paraffin o nga autopsies. Ko te DNA he rereke te roa o te mahanga toharite kei roto i nga tangohanga i runga i te tikanga whakatika. I tiakina te DNA i te wa e mau ana i roto i nga tauira tio maaori me te formalin korea. Ko te whakamahinga o te Bouin tino waikawa, he mea karekau ranei, he formalin kei roto i te waikawa i roto i te waikawa i mate nui te DNA. Ko te hautau e toe ana he tino wehewehe.
Kei te taha maui, ka whakaatuhia te roa o nga kongakonga ki nga takirua kiropapapa (kbp)

Whakaahua 2 | Te ngaronga o te tapatahi o nga whaainga waikawa karihi
(a) Ko te 3′-5′ te āputa i runga i ngā whenu e rua ka puta he whati i roto i te DNA ūnga. ka puta tonu te whakahiatotanga o te DNA ki te kongakonga iti. Heoi, mena kei te ngaro tetahi waahi whakauru tuatahi i runga i te kongakonga DNA, ka puta ko te whakakaha raina anake. I roto i te take tino pai, ka taea e nga kongakonga te whakakotahi ano tetahi ki tetahi, engari ka iti nga hua ka iti ake i nga taumata kitenga.
(b) Ko te ngaronga o nga turanga, ko te nuinga na te whakahekenga me te hanga timidine dimer, ka heke te maha o nga here-H me te heke o te Tm. I roto i te wa whakamahana roa, ka rewa nga mea tuatahi mai i te DNA matrix, ka kore e whakapouri ahakoa i raro i nga tikanga tino uaua.
(c) Ko nga turanga thymine e tata ana ka hanga he riima TT.
Ko tetahi atu raruraru ka puta i te nuinga o nga wa i roto i nga tātaritanga rapoi ko te tukunga iti ake i te tino pai o nga waikawa karihi i whakaritea ki te tangohanga phenol-chloroform. I roto i nga take tino nui, ka taea te hono atu ki nga kino kino. He nui te wa ka taea te whakaora ma te koropuha lysis me te nakunaku enzymatic o nga otaota pūtau, engari ko tenei tikanga ka iti te PCR na te iti o te tuku waikawa karihi.

Te aukati i te mahi polymerase i te wa e whakakaha ana

I te nuinga o te waa, ka whakamahia te aukati hei ariā ipu hei whakaahua i nga ahuatanga katoa e arahi ana ki nga hua PCR iti rawa. I roto i te tikanga matū koiora, he whakawhäitihia te aukati ki te ngohe o te enzyme, arä, ka whakaiti, ka aukati ranei i te hurihanga o te tïpako-hua na roto i te pahekoheko ki te waahi kaha o te DNA polymerase, tona cofactor ranei (hei tauira, Mg2+ mo Taq DNA polymerase).
Ko nga waahanga kei roto i te tauira, i nga momo parepare me nga tangohanga kei roto nga reagents ka taea te aukati tika i te whaariki, te mahanga ranei i ona kaihanga (hei tauira, te EDTA), na reira ka kore e whakakorikori i te polymerase ka puta ki te heke iho, ki nga hua kino PCR kino ranei.
Heoi ano, he maha nga taunekeneke i waenga i nga waahanga tauhohenga me nga waikawa karihi kei roto i te whaainga ka tohua ano he 'kaiwhakahaere PCR'. Kia pakaru te tapatahi o te pūtau e te wehe me te tuku i te waikawa karihi, ka puta nga taunekeneke i waenga i te tauira me tona otinga a tawhio noa me te wahanga totoka. Hei tauira, ka taea e te 'scavengers' te here i te DNA whenu kotahi-rua ranei na roto i nga taunekeneke kore-kovalent me te whakararu i te wehenga me te purenga ma te whakaiti i te maha o nga whaainga ka tae ki te waka tauhohenga PCR.
I te nuinga o te waa, kei roto i te nuinga o nga wai o te tinana me nga reagents e whakamahia ana mo nga whakamatautau whakamatautau haumanu (urea i roto i te urine, hemoglobin me te heparin i roto i te toto), nga taputapu kai (waahanga pararopi, glycogen, ngako, Ca2+ katote) me nga waahanga o te taiao (phenols). , konganuku taumaha)

Ka kitea etahi atu aukati PCR i roto i nga huakita me nga pūtau eukaryotic, te DNA kore-whaainga, nga macromolecules herea DNA o nga matrices kiko me nga taputapu taiwhanga penei i nga karapu me nga kirihou. Ko te purenga o nga waikawa karihi i te wa, i muri ranei i te tangohanga ko te tikanga pai mo te tango i nga aukati PCR.
I tenei ra, ka taea e nga momo taputapu tango aunoa te whakakapi i nga tikanga a-ringa, engari 100% te whakaora me te purenga o nga whaainga kaore ano kia tutuki. Kei te noho tonu pea nga kai aukati i roto i nga waikawa karihi kua purea, kua whai mana ranei. He rereke nga rautaki hei whakaiti i te paanga o nga aukati. Ko te whiriwhiringa o te polymerase e tika ana ka whai paanga nui ki te mahi aukati. Ko etahi atu tikanga kua whakamatauhia hei whakaiti i te aukati PCR ko te whakanui ake i te kukū polymerase, te tono taapiri penei i te BSA.
Ko te whakakore i nga tauhohenga PCR ka taea te whakaatu ma te whakamahi i te mana whakahaere kounga o roto (IPC).
Me tupato ki te tango i nga reagents katoa me etahi atu otinga i roto i te kete tangohanga, penei i te waihano, EDTA, CETAB, LiCl, GuSCN, SDS, isopropanol me te phenol, mai i te waikawa karihi ka wehea ma te horoi horoi. I runga i to raatau kukū, ka taea te whakahohe, te aukati ranei i te PCR.